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詳細分析杜恩斯勻漿器的操作步驟流程

更新時間:2019-11-20   點擊次數:2142次
   杜恩斯勻漿器的電源是兩個AA干電池,可直接用在離心管里勻漿,配上不同的槌和管便可實現從0.5ml至50ml的組織勻漿;勻漿快速,便用輕便,操作簡單,無需特別維護。提供無菌包裝,無DNA酶和RNA酶,無致熱源的一次性使用槌;也有可反復使用的聚丙烯(PP)材料槌和不銹鋼(SS)槌。
 
  杜恩斯勻漿器的操作步驟:
  1、獲得目的基因:
  a、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物,PCR循環獲得所需基因片段。
  b、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第1鏈,以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。
 
  2、構建重組表達載體:
  a、杜恩斯勻漿器載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
  b、PCR產物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
 
  3、獲得含重組表達質粒的表達菌種:
  a、將連接產物轉化大腸桿菌DH5α,根據重組載體的標志作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。
  b、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
  c、以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。
 
  4、誘導表達:
  a、杜恩斯勻漿器挑取含重組質粒的菌體單斑至2mlLB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養。
  b、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中,37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。
  c、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。
  d、分別取菌體1ml,離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl1%SDS重懸,混勻,70℃10min。
  e、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。




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